藥物代謝基因 & Tacrolimus 慢性肾毒性 !!

基因多态性与他克莫司的慢性肾毒性 发布时间：2013-1-15 来源：药品资讯网信息中心

他克莫司 以他克莫司为代表的神经钙蛋白抑制剂(CNI)是实体器官移植免疫抑制方案的重要组成部分。20世纪80年代早期被应用于临床后，大大提高了肾移植的短期成功率，目前移植物1年存活率已超过90%。他克莫司是从链霉菌属中分离出的发酵产物，其化学结构为23元大环内酯类抗生素。 它主要通过与细胞内免疫嗜素FK结合蛋白(FKBP)结合而抑制Th细胞释放白细胞介素2(IL-2)、IL-3、干扰素γ（IFN-γ）并抑制IL-2R表达，从而全面抑制T淋巴细胞的作用。他克莫司作为一种强力的新型免疫抑制剂，已成为肝、肾、心脏等实体器官移植免疫抑制方案的一线用药。但同时它也存在许多不良反应如肾毒性、神经毒性、糖耐量下降、肝功能异常、高血压等。

他克莫司肾毒性 他克莫司的肾脏毒性有急性和慢性两种形式。急性肾毒性以可逆的肾血管阻力变化为特点，即肾血流量减少和肾小球滤过率(GFR)下降，急性毒性呈剂量依赖性并且可逆。他克莫司对肾脏血管系统的直接作用和系统应答，涉及交感神经系统、肾素。血管紧张素系统的参与，导致内源性的缩血管物质和舒血管物质失衡：包括血栓烷A2的增加和前列腺素E2的减少，也包括内皮缩血管肽1释放增加和一氧化氮合成减少。 他克莫司慢性肾毒性呈非剂量依赖性且不可逆，多表现为由于肾脏结构改变而导致的肾血流动力学变化。这些结构性的改变累及肾脏的三个重要组成部分：血管（小动脉透明变性、动脉纤维膜增厚）、肾小管间质（间质纤维化、肾小管萎缩）和肾小球（肾小球硬化）。肾素-血管紧张素-醛固酮系统同样参与了他克莫司慢性肾毒性的发生过程。 他克莫司具有肾脏毒性已被广泛认识，但其慢性肾毒性的发病机制和影响因素尚不完全清楚。 基因多态性对他克莫司药物浓度的影响他克莫司的治疗窗狭窄，个体药物代谢差异很大。临床上必须严密监测药物浓度以保证其达到安全、有效的治疗浓度，这是他克莫司临床应用的一个难点。但也正因如此，才使得对于他克莫司代谢相关的研究尤为深入。已发现多种基因参与他克莫司的药代动力学( CYP3 A5、ABCBl)和药效动力学[转化生长因子p( TGF-3)、CYP2C8、血管紧张素转化酶(ACE)、CC趋化因子受体5(CCR5)]过程。 基因多态性是指在一个生物群体中，存在两种或多种不连续的基因型或等位基因，从本质上来讲，多态性是基因水平上的变异，基因的多态性直接导致了生物繁殖过程中转录和翻译的选择多样性。药物代谢相关的基因多态性造成了个体间他克莫司药物浓度的差异，但它们是否对他克莫司的慢性肾毒性产生影响尚无定论。

可能有关的基因 CYP3 A5 CYP3 A5是人体内他克莫司最关键的代谢酶。他克莫司口服后主要在空肠和回肠吸收，在肝脏代谢，表达于肠道和肝脏的CYP3A5参与其代谢过程，并在药代动力学方面起重要作用。研究表明，不同的CYP3 A5基因型是造成他克莫司生物利用度个体差异的主要原因。 具体而言，CYP3 A5的突变位点，野生型定义为*1，而6986A->G突变被定义为CYP3A5*3。CYP3A5*1等位基因携带者肠道及肝脏中CYP3A5表达较高，而CYP3A5*3等位基因携带者肠道及肝脏中CYP3 A5表达非常低。从而使携带CYP3A5*3等位基因的患者服用同等剂量的他克莫司，其血药浓度高，而携带CYP3A5 *1等位基因的患者，尤其是*1/*1型纯合子，血药浓度明显偏低。 如上所述，CYP3 A5基因多态性通过影响他克莫司药物代谢而造成个体间他克莫司药物浓度差异，那么，它对他克莫司慢性肾毒性是否也存在影响？ Kuypers等对95例肾移植患者随访观察5年的研究是迄今纳入病例最多、随访时间最长的研究，该研究发现，肾移植术后3个月，携带CYP3A5 *1等位基因者较携带CYP3A5*3等位基因者更易出现他克莫司慢性肾毒性，他们定义的他克莫司慢性肾毒性是移植肾活检显示的新发生的小动脉透明变性。 然而，Chen等的观察结果却与以上相反，67例肾移植受者中CYP3A5*3/*3型患者他克莫司肾毒性的发生率较水11*1型患者明显升高，该研究移植肾活检的时间是术后1月，定义他克莫司肾毒性的组织学标准是肾小管空泡变性、间质纤维化和血管透明变性。 除以上两种结论外，Queineh等研究认为，不同的CYP3 A5基因型影响肾移植受者术后所需的药物剂量和移植物预后：CYP3A5*1／*1型患者术后所需的药物剂量大于CYP3A5*3/*3型患者和CYP3A5 *1/*3型患者，且移植肾急性排斥发生率高于后两种基因型患者；但不同的CYP3 A5基因型与他克莫司相关肾毒性并无明显关系。 上述研究观察139例患者，69例进行了移植肾活检，采取的组织学标准参考Banff 2005。Naesens等观察252例患者，肾移植术后随访3年，定期进行移植肾活检，他们发现CYP3 A5基因多态性对他克莫司药代动力学有显著影响，但对移植肾的组织学改变无影响。 在肝脏移植和心脏移植方面，Fukudo等观察60例肝移植患者，Klauke等观察53例心脏移植患者，均未发现CYP3A5基因多态性与他克莫司相关肾毒性有关。但他们均未采用组织学指标进行评价，而是以血清肌酐( SCr)上升作为诊断他克莫司肾毒性的标准。

不同的研究出现不尽一致的结果，分析其原因可能是：

(1)他克莫司慢性肾毒性的评价标准不同。有的研究以移植肾组织学改变为标准，有的研究仅观察患者的SCr升高；采用的组织学标准也并不统一，有的以肾组织小动脉透明变性定义他克莫司慢性肾毒性，有的则以间质纤维化、血管透明变性为标准，但目前国际尚无明确而统一的量化标准。 此外，值得注意的是，仅非常少量的研究能够提供供肾活检或零点活检。对他克莫司肾毒性的最为科学的诊断标准是对照供肾活检（或零点活检），是否存在术后新发生的移植肾小动脉透明变性及间质条索状纤维化。必须考虑到缺乏供肾活检或零点活检，使术后一段时间进行的移植肾活检很难排除供肾即存在的小动脉透明变性和间质纤维化。

(2)活检时间不同。不同的研究在移植肾活检时间的选择上有很大差异，有的研究进行移植肾活检的时间为术后1月，并以此活检结果进行诊断，而有的研究选取术后3月进行移植肾活检，且随访至术后数年进行多次活检。

(3)样本量差异较大。总之，目前尚无就CYP3A5基因多态性与他克莫司慢性肾毒性是否相关的问题的多中心、大样本研究，部分研究的样本量仅几十例，因此，可能导致研究结果的不一致。 ABCB1 ABCB1基因编码P-糖蛋白。P-糖蛋白在很多正常组织和器官的细胞中有丰富的表达，是细胞膜上的药物外排转运载体蛋白，将药物从细胞内主动转运至细胞外，从而降低细胞内的药物浓度，在多种药物代谢过程中起重要作用。在人体，环孢素A和他克莫司均由P-糖蛋白转运，该转运行为与降低药物的胞内浓度和相关毒性有密切关系。 目前药物遗传学相关研究主要聚焦于ABCBl *13单体型的编码变异，其中两种(2677和2435)变异与P-糖蛋白的活性改变有关。2677G>T变异影响细胞间底物依赖的转运过程，其造成转运的增加、降低、不变均有报道。3435C>T同义突变不影响蛋白质序列，也不影响底物特异性的改变。然而，此多态性与等位基因特异性表达相关，并且肝脏ABCBl mRNA水平与3435基因型相关。 Naesens等观察252例肾移植患者（以移植肾间质纤维化／肾小管萎缩定义他克莫司慢性肾毒性）发现，ABCB1基因型与组织学上的慢性肾毒性有明确关系。与非C3435T纯合子相比，当供者和受者都是ABCB1 3435T位点上的纯合子，发生移植肾间质纤维化／小管萎缩的比值比高达3. 9(95% CI2.0~7.6，P<0. 001)。 Hebert等观察120例肝移植受者（其中31例服他克莫司）发现，50 %的ABCB1 11/22单体型(2677G，3435C/2677T，3435T)患者出现肾功能不全( SCr≥1.6 mg/dl)，仅31%的ABCB1 11/11单体型(2677G，3435 C/2677G，3435C)患者和11. 2%的ABCB1 22/22单体型(2677T，3435T/2677T，3435T)患者出现肾功能不全。他们仅观察SCr的升高，未获取病理学标本。另有三项研究（2项肾移植、1项心脏移植[21-23]）未发现ABCB1基因多态性与他克莫司肾毒性相关。 与成人的研究结果不完全一致，Hawwa等观察51例服用他克莫司的儿科肝移植患者发现，ABCB1基因多态性与术后6月GFR降低30 %的发生率密切相关，而术后1年不同的ABCB1基因位点和单体型对GFR均无影响。Grenda等观察207例接受肾移植的儿童（61例服他克莫司）发现，ABCB1基因多态性与肾毒性无关，在该研究中，部分患者进行了移植肾活检（但未定义具体的标准），部分患者仅有持续的肾功能减退同时合并少尿和（或）肾小管酸中毒。 综上所述，目前对于ABCB1基因多态性与他克莫司慢性肾毒性是否相关尚无确定结论。分析各种研究产生不同结果的可能原因有：(1)样本量小，大多数研究仅几十例患者；(2)多种免疫抑制方案，在评价CNI肾毒性时，部分患者服他克莫司，部分患者服环孢素A( GsA)，大多数研究并未将两者分开讨论，且与之联合的免疫抑制剂分别有骁悉、硫唑嘌呤等；(3)评价的时间不同；(4)他克莫司肾毒性的评价标准不同。

CYP2C8 CYP2C8是存在于肾脏中的参与花生四烯酸(AA)代谢的酶。AA在细胞色素P 450介导下，通过环氧化作用产生肾脏内源性的具有血管保护作用的环氧花生四烯酸( EETs) 。EETs在维持血压恒定中有多种重要作用，包括肾小管对水的重吸收和Na+的转运、抗炎作用、维持血管平滑肌张力等。EETs主要表现舒血管作用，可能在肾脏局部对抗他克莫司的缩血管作用。肾脏EETs的减少可能导致肾脏局部血压升高，这被认为是他克莫司慢性肾毒性产生的一个机制。 目前仅有肝移植领域的一项观察研究CYP2 C8基因多态性与他克莫司慢性肾毒性的关系。Smith等观察163例肝移植受者，其中41例服用他克莫司，以移植3年后SCr>1.6 mg/dl作为肾毒性指标，发现携带CYP2C8 *3基因位点与较高的他克莫司慢性肾毒性风险有关( OR 16. 67，95% CI 2.8~99.6)，可能与肾组织血管保护作用的EETs生成减少相关。 以上的研究结果强烈提示CYP2 C8基因多态性对成人肝移植后他克莫司慢性肾毒性存在影响。但目前尚无肾移植领域的相关研究，现有的研究也未观察肾脏病理。 血管紧张素转化酶(ACE) 大量文献表明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活在CNI慢性肾毒性中起重要作用。动物研究已经发现，CsA能极大地提高血浆肾素活性，同时引起肾功能减退和血压升高；并研究发现，ACE抑制剂类似物能够拮抗CsA引起的以上改变。此外，使用血管紧张素II受体拮抗剂能阻断或减轻他克莫司或CsA引起的TGF-β表达增加、巨噬细胞浸润、骨桥蛋白表达和间质纤维化。 ACE的基因变异有I(Insertion)和D(Deletion)两种形式，分别指ACE基因内含子16的一个287碱基序列的插入或删除。ACE D基因型与血清ACE活性升高有关，不同个体血清中ACE活性以D/D型最高，D/I型次之，I/I型最低。 为研究ACE基因型在CNI慢性肾毒性发生过程中的影响，Gallon等回顾性地观察143例肝移植受者（其中100例服他克莫司），以SCr≥1.5mg/dl作为肾损伤指标，发现ACE D/D基因型与肾功能不全的发生风险显著相关( RR 4.3，95% CI 1.9~9.7，P=0. 000 1)。虽然该项研究同时存在他克莫司/CsA这两种CNI，但他克莫司占绝大多数(100/143)，因此，此项研究强烈提示在服用他克莫司的成人肝移植受者，ACE基因型与慢性肾功能不全的发生风险确有关系。

转化生长因子β(TGF-β) TGF-β是一种多功能的细胞因子，有潜在的促纤维化作用，可能与调节巨噬细胞功能和细胞外基质成分表达有关。TGF-β在组织损伤的正常修复过程中起重要作用，其表达失衡参与许多疾病的进展过程。研究发现，不论在体外还是体内、人类还是动物，CsA均能使TGF-β表达增加。其亚型TGF-β作为一个主要介质，参与多种纤维化性疾病的进程，并且可能与CsA慢性肾毒性相关。 两种基因多态性影响TGF-β的生物学功能，源于一个信号肽的不同：Leul0→Pro和Arg25→Pro。这些多态性与体内的和体外的细胞因子产生相关，Leul0和Arg25的携带者能产生较多的TGF-β。 van de Wetering等观察402例心脏移植受者，其中21例服他克莫司。TGF-β基因Leul0和Arg25携带者分别与2.9(95% CI l.5~5.8，P=0. 002)和2.6(95% CI l.4~4.8，P=0.002)的发生终末期肾病的相对危险度相关。然而，Klauke等观察106例心脏移植受者（其中42例服他克莫司），却未发现此基因多态性和肾功能不全相关。以上两项研究，前者以需要肾脏替代治疗定义ESRD，后者以SCr≥1.8 mg/dl定义肾功能损伤。这两项研究均没有针对服用他克莫司的患者进行单独分析。

CC趋化因子受体5(CCR5) CCR5是趋化因子受体的一种亚型，是趋化因子RANTES、MIP-l&alPHa;、MIP-1β的受体，主要表达在Thl细胞，还表达在单核细胞、巨噬细胞、自然杀细胞和树突状细胞。趋化因子调节免疫反应过程中白细胞的募集，动物模型已经证明，趋化因子的作用与移植物排斥反应中白细胞浸润相关，在移植物模型中使用趋化因子受体拮抗剂能延长移植物的存活时间。CCR5与多种趋化因子相互作用，参与移植物的免疫反应过程。 CCR5 32突变是指CCR5等位基因编码区第185位氨基酸密码子以后发生32个碱基对的缺失，发生此突变后产生无功能的CCR5 。既往研究发现，CCR5 32纯合子的肾移植受者有更长的移植物存活时间。 为研究儿科患者免疫抑制剂相关肾毒性，Grenda等分析207例小儿肾移植受者免疫抑制剂相关的基因背景，使用PCR和PCR-RFLP技术筛查MDR1、CYP3A5、IL1B、CCR5等多种基因的多态性，用病理和（或）临床指标（具体标准未列出）定义CNI慢性肾毒性发现，他克莫司慢性肾毒性与CCR5基因多态性相关：CCR5 32突变存在于21%的未表现出CNI肾毒性的患者中(P<0.041)，而所有出现CNI肾毒性的患者均无CCR5 32突变。该作者进一步观察发现，CCR5 32基因型还与术后1年的移植物功能相关，携带CCR5 32基因型的受者，术后1年GFR显著高于非携带者。其他基因多态性未显示与他克莫司慢性肾毒性明确相关。

总 结 药物相关基因的多态性的研究，属于药物基因组学的范畴。药物基因组学发展于在20世纪90年代末，是基于功能基因组学与分子药理学的一门科学。遗传多态性是药物基因组学的基础，包括药物代谢酶、转运体、受体及药物靶标基因的多态性。这些多态性的存在可能导致药物疗效和不良反应的个体差异。 具体到他克莫司，这一移植领域广泛应用的、个体代谢差异大且临床治疗窗狭窄的药物，大量研究表明，其药物效应受多种基因多态性的影响。他克莫司慢性肾毒性，作为其重要的药物不良反应之一，目前尚无明确的证据证明哪些基因与其确切相关。 但，通过回顾和分析以往的研究，我们认为药代动力学方面，CYP3A5、ABCB1，药效动力学方面，CYP2C8、TGF-β可能与其相关。进一步的临床试验，如包含所有感兴趣基因在内的前瞻性研究，将可能得到更为确切的结果。