肝癌誘導（V352I） 比 AURKA野生型- AURKA（WT）更早 更嚴重

國衛院分基所斑馬魚研究成果登上國際期刊 文 李淑慧 2019.12.14利用斑馬魚的高通量藥物篩選平台可由篩選小分子化學物庫鑑定出候選化合物預防肝癌。精準醫學、個人化醫療，能夠協助醫師針對個人量身定做，並在關鍵時刻給予正確藥物，大幅提高療效，早期發現疾病，並透過精準方式早期治療是最新趨勢。國衛院分基所喻秋華博士實驗室以其於研究領域之專業優勢，配合學研界及產業界資源，加上與臨床醫生合作，強化轉譯研究，落實以斑馬魚模式作為研究人類疾病和維護健康的目標。今年，2019，喻秋華博士在衛生福利部(衛福部)「健康醫藥生技前瞻發展計畫」經費支持下，陸續發表利用斑馬魚模式研究AURKA（V352I）突變促進肝癌發生、並利用斑馬魚模式抑制肝癌藥物之研究報告。團隊更致力於篩選降低脂肪肝、緩解先天性肌病等藥物，研究佳績連連。國家衛生研究院分子與基因醫學研究所研究員喻秋華博士特別接受採訪，詳述今年刊登於國際期刊的四個研究及相關計畫，分別為：

一、通過激活斑馬魚中的不同途徑，一種新型AURKA突變體誘導的早發性嚴重肝癌發生大於野生型 極光A激酶（AURKA）是有絲分裂進程中的重要調節劑，在包括肝癌在內的人類癌症中經常過度表達。在癌症患者中發現了許多AURKA突變。在小鼠過表達的野生型Aurka長時間後肝癌的發生率很低。然而，從有過任何突變型AURKA動物模型，突變AURKA介導的肝癌發生的機制仍不清楚。該中心從臨床標本中鑑定出一個新的AURKA突變，其中a.a.352纈氨酸為異亮氨酸（V352I）。通過使用肝臟特異性表達AURKA突變型和AURKA野生型的轉基因魚，AURKA突變型-AURKA（V352I）誘導的肝癌發生比AURKA野生型- AURKA（WT）更早且更嚴重。儘管在AURKA（V352I）和AURKA（WT）轉基因魚中均觀察到脂肪生成酶和脂肪生成因子的表達增加，但與AURKA（WT）相比，AURKA（V352I）在3個月時具有更大的促進纖維化的可能性。此外， AURKA（V352I）突變型轉基因魚中的細胞週期/增殖標誌物的表達水平高於AURKA（WT），這表明AURKA（V352I）突變型可能會加速肝癌進程。此外，發現AURKA（V352I）突變型激活AKT信號並增加核β-catenin，但AURKA（WT）僅激活膜形式的β-catenin，這可能是造成差異的原因。在這項研究中，他們提供了一個新的見解，即AURKA（V352I）突變可能通過與AURKA（WT）不同的途徑激活而促成早期肝癌的發生。這種轉基因魚可作為潛在的精準藥物治療的藥物篩選平台。此成果發表於今年7月份的Cancers (Cancers 2019 Jul 2;11(7))

二、基於基因體學研究飲食誘導肥胖與HBx，Src和p53突變協同作用加速了斑馬魚模型中的肝癌發生 研究肥胖症斑馬魚模式和遺傳因素誘發肝病的分子機制及進行藥物之選擇肥胖症斑馬魚模式。肝癌的主要類型-肝細胞癌與非酒精性脂肪性肝炎，糖尿病和肥胖症有關。以往的研究已經確定了一些遺傳風險因素，如B型肝炎病毒X抗原，SRC致癌基因的過表達和p53抑癌基因的突變;然而，飲食與遺傳風險因子之間的協同作用仍不清楚。為了研究飲食和肝癌發生中遺傳風險因素之間的協同作用，喻秋華博士使用具有四種遺傳背景和過度餵食或高脂飲食誘導肥胖的斑馬魚模型分析特定基因表達及組織病理學變化，與交通大學楊進木教授合作，研究全基因體基因變化。結果表明，過量餵食和高脂飲食可以誘導野生型魚類肥胖和非酒精性脂肪性肝炎。HBx過表達加上p53突變HBx(p53-)；或Src過表達加上p53突變Src(p53-)可增加脂肪生成因子（pparg、srebf1、chrebp），脂肪生成酶（agpat、fasn、pap）和細胞週期相關基因（ccne1、cdk1、cdk2）的表達，且Src(p53-)比HBx(p53-)具更大的影響。在HBx及Src過表達加上p53突變HBx,Src(p53-)三重轉基因斑馬魚中，飲食誘導的肥胖在5個月時有肝細胞癌的形成，並使癌症發病率增加了三倍。四種遺傳背景和過度餵食或高脂飲食誘導肥胖的斑馬魚的肝臟也進行次世代定序及微陣列得到全基因體表現數據。研究團隊開發了一種基因體學數據分析方法，用於分析轉錄體的基因，途徑和生物系統。結果表明，兩個KEGG系統，代謝和遺傳信息處理、脂肪酸代謝、類固醇生物合成和核醣體生成的途徑在肝癌形成中被激活。相反，胰島腺信號傳導途徑，胰島素抗性和p53信號傳導途徑在肝細胞癌中降低。研究結果表明，過度餵食或高脂飲食與遺傳風險因子之間具有協同作用，通過影響脂肪酸代謝和核醣體生成而引起肝癌。此成果發表於今年11月份的Cancers (Cancers 2019 Nov., 11(12):1899)

三、以斑馬魚模式，發展出高通量之藥物篩選平台，篩選出嶄新且更安全的肝癌藥物 肝癌是全球因癌症致死率排名第4的癌症，目前仍未有好的治療策略，亟需開發肝癌的治療藥物。國衛院分基所喻秋華研究員在衛生福利部「健康醫藥生技前瞻發展計畫」經費支持下，致力於斑馬魚研究，以斑馬魚模式，發展藥物篩選平台。利用血管螢光斑馬魚胚胎，建立快速尋找抗血管新生(anti-angiogenesis)的藥物，藉由異種移植將肝癌細胞打入兩天大的斑馬魚胚胎，測試藥物抑制癌細胞增生和轉移的作用。也利用肝臟紅螢光的轉基因斑馬魚胚胎測試肝毒性，及斑馬魚胚胎毒性。可兼具高通量，檢測有效性與高安全性的藥物。此研究以國衛院生藥所蔣維棠與徐祖安博士提供的兩種酪氨酸激酶抑制劑 (419S1及420S1)，與已通過FDA核准的肝癌藥物Sorafenib等三種化合物為研究標的，利用上述平台，分析其治療指數(therapeutic index，即LC50/IC50)。結果顯示，三者都可以抑制血管新生，也都可以有效的抑制癌細胞增生和轉移。419S1有較低的肝毒性及胚胎毒性，且以419S1之治療指數最高。進一步利用具有肝癌之斑馬魚成魚，眼窩注射或口服餵食小分子藥物，確認小分子藥物可抑制肝癌形成。最後與萬芳醫院吳明順醫師合作，將人類肝癌組織細胞植入斑馬魚胚胎，整體而言419S1及420S1抑制病人肝癌細胞增生的能力，皆優於Sorafenib，但具有個人差異性。透過此篩選平台，可以更快速地尋找出既有效又安全的個人化治療肝癌藥物，此成果發表於今年5月份的Cancers (Cancers, 2019 May 28;11(6))

四、以高通量斑馬魚藥物篩選平台從兩千多個小分子化合物篩選出兩種抑制斑馬魚肝癌形成的新型化合物，並證明它們與納米鑽石的結合，進一步降低毒性 使用斑馬魚模型，喻老師實驗室篩選了數百個小分子並鑑定出兩種化合物（LIB1O0078和LIB1O0144）表現出最強的抗血管生成而沒有副作用。通過異種移植試驗，LIB1O0078具有更好的抗增殖能力，LIB1O0144具有更好的抗遷移能力。此外，使用注射化合物到Tg（HBx，src，p53-）肥胖魚肝癌的血液中，喻老師實驗室發現LIB1O0078和LIB1O0144具抗肝癌效應。還檢查了他們的肝毒性，發現LIB1O0078和LIB1O0144的肝毒性低於Sorafenib。使用患者來源的癌症異種移植模型，顯示LIB1O0078和LIB1O0144對於肝癌患者比Sorafenib更有效。納米鑽石具有高生物相容性，螢光和功能性載體的優點，喻老師進一步與慈濟大學張新侯教授合作，將納米鑽石包覆小分子藥物。發現納米鑽石包覆LIB1O0078和LIB1O0144降低了胚胎毒性和肝毒性。此外，使用口服餵食納米鑽石包覆LIB1O0078和LIB1O0144給HBx,src,p53-肥胖肝癌成魚，發現納米鑽石包覆LIB1O0078和LIB1O0144具有更好的抗肝癌效果。研究團隊證明了斑馬魚平台是鑑定新型抗癌藥物的優秀模型。此研究整合了納米技術和生物醫學技術。最終目標是使用患者衍生的癌症異種移植模型，開發肝癌個人化醫療。通過這種快速篩選系統，具有不同遺傳背景的癌症患者可以得到個人化和及時的治療方式。此成果發表於今年10月份的Advanced Therapeutics (Advanced Therapeutics. 2019 Oct., 1900105)。

五、褐藻醣膠通過激活ASGPR / STAT3 / HNF4A軸保護肝細胞免受致癌物的侵害 利用斑馬魚模式來評估褐藻醣膠的幅射保護效果及褐藻醣膠配合放療治療癌症的效果生，並利用GeneTitan的技術來進行全基因組譜分析。喻老師實驗室發現褐藻醣膠藉由受體活化STAT3增加HNF4A轉錄因子重置肝細胞基因調控網路以減低輻射誘導的肝纖維化。以放射線處理(10Gy, 40Gy)可以誘發肝纖維化，而且放療之前使用褐藻醣膠可以減少纖維化。10Gy, 40Gy放射可促進肝纖維化的標誌物hpse, ctgfa表現上升，若放療之前使用褐藻醣膠可有效減少hpse, ctgfa表達。基因組分析分析顯示，放療之前褐藻醣膠使用可促進23個基因(包含 hnf4a，ddah1及hsd11b1高表現)，若這些基因高表現可提高肝癌病人存活率。而HNF4A是驅動基因。10Gy放射之前若先使用褐藻醣膠可以促進hnf4a表現。體外競爭試驗顯示褐藻醣膠可與肝細胞ASGPR1/2受器結合，褐藻糖膠處理增加激活pSTAT3蛋白水平，而且HNF4a promoter上具有STAT3 binding site。10Gy放射之前若先餵食褐藻醣膠可以促進褐藻醣膠受器: asgr表現及促進hnf4a downstream target: tdo2a表現。研究結果為台灣小分子褐藻醣膠降低輻射誘導的纖維化、肝癌提供了證據。目前已經彙整實驗結果並投稿到國際期刊 。

六、利用轉殖基因斑馬魚成魚，測試CD36過度表現是否造成肝功能失常 CD36（也稱為脂肪酸轉移酶（FAT））在肝臟中主要發揮著脂肪酸攝取及結合氧化的低密度脂蛋白等作用，在非病毒性肝炎引發的肝癌患者中發現其基因擴增及表達上升。CD36高表達引起肝癌的作用以及CD36與飲食因子之間的協同作用仍不清楚。使用的CD36轉基因斑馬魚處理不同飲食，目的是了解CD36表達上升會對肝臟造成什麼影響、CD36與飲食因子之間的協同作用，並利用此平台篩選抗脂肪累積和抗肝癌的藥物。總結，研究證明了CD36在脂質體內平衡和肝細胞瘤細胞增殖之間的相互關係，並證明了香椿樹皮提取物及鯽魚水萃物香椿對於降低脂肪肝、抑制肝癌等助益。

七、利用斑馬魚模式研究原肌球蛋白3的新生突變造成先天性肌病 先天性肌病是一種具有遺傳性和臨床異質性的肌肉疾病，其主要特徵為肌肉無力、肌張力減弱、運動發育遲緩。先天性肌病以肌肉切片所見的特徵進行命名。大部分的先天性肌病患者病情是進行性且罕見的，但目前的醫療對於先天性肌病沒有明確的治療方式。此研究與高雄醫學大學校長鐘育志醫師合作，建立了轉基因斑馬魚動物模型，探討TPM3(E151G)和先天性肌病之間的病理關係，研究致病機轉和開發藥物篩選平台。透過使用此斑馬魚模型作為臨床前模型，不僅可以研究TPM3(E151G)突變引起之先天性肌病的致病機制，並為這種罕見的人類遺傳疾病開發個人化的藥物篩選。目前正在進行的研究尚有:鯽魚水萃物及香椿的萃取物對於降低脂肪肝、抑制肝癌等。喻秋華博士表示，斑馬魚為研究遺傳與發育之重要模式動物之外，可進一步做為人類疾病研究的動物模式，並希望更多人能夠了解斑馬魚模式的優點並且得到適合他們的藥物治癒他們的疾病。2017年5月，國衛院臺灣斑馬魚核心設施成立「斑馬魚醫藥健康產學技術平台」，提供一站式服務並發展前瞻技術。為使服務更全面性且多元，2019年5月獲科技部支持，在中研院臺灣斑馬魚核心設施加入後，轉型為「臺灣斑馬魚技術與資源中心」，除了提供以往原有之服務，包含基因敲除魚、基因轉殖魚、藥物篩選及毒性測試等項目，中心亦新增斑馬魚研究所需之各項資源以及相關教育訓練等服務。「臺灣斑馬魚技術與資源中心」可提供各項斑馬魚相關研究平台服務。