訊近年來，免疫治療引領了腫瘤治療的重大變革。在PD-L1高表達或高腫瘤突變負荷（TMB）的患者中，免疫治療的療效更為顯著。TMB的傳統檢測方法是全外顯子測序（WES），那麼靶向測序是否可以準確檢測TMB？一項在10萬例腫瘤患者中進行的大型驗證性研究證實，FoundationOne️® assay可以準確評估TMB，FoundationOne️®assay和WES檢測的TMB高度相關。然而上述方法使用的是組織樣本，為了解決晚期腫瘤患者組織樣本難以獲取這一問題， Foundation Medicine Inc.（FMI）與基因泰克近日聯合開發了一種基於外周血檢測TMB的方法（bTMB），通過嚴謹的驗證分析證實其可以準確檢測TMB，同時在大樣本臨床試驗中進一步證實了bTMB的應用前景，結果發表在Nature Medicine雜誌。這是首次證實bTMB可準確重複測量，並且與免疫檢查點抑制劑的療效相關。本刊對該研究進行全面梳理，並特邀中國人民解放軍總醫院胡毅教授進行點評，以饗讀者。靶向測序FoundationOne️® assay檢測TMB的驗證分析TMB傳統檢測方法是全外顯子測序， 那麼靶向測序是否可以準確檢測TMB？一項發表在Genome Medicine上的研究對這一問題進行了深入探索。
1．FoundationOne® assay和WES檢測TMB結果高度一致 該研究首次探索了採用靶向315個基因（1.1Mb的編碼基因）的全面基因組測序（CGP，FoundationOne® assay）評估整個外顯子區的TMB的準確性。首先對29個腫瘤組織標本進行FoundationOne® assay檢測和全外顯子組測序（WES），計算體細胞編碼區每百萬堿基的堿基置換和插入缺失突變數。使用WES對腫瘤組織和正常組織進行測序，以區分體細胞突變和胚系基因多態性。FoundationOne® assay沒有配對的正常組織，但對基因變異進行了嚴格的篩選以排除胚系基因多態性。結果顯示採用兩種方法計算的TMB高度相關（R2=0.74；見圖1a）。接下來，研究者評估了FoundationOne® assay檢測TMB的可重複性。對60例接受FoundationOne® assay檢測的標本進行多次檢測，比較同一標本TMB檢測的重複性。結果顯示，各次檢測的TMB高度相關（R2=0.98；見圖1b），提示FoundationOne® assay可以準確檢測TMB。此外，研究者還進一步在更大樣本量的患者中分析了FoundationOne® assay和WES檢測TMB的一致性。納入35項研究的8917例腫瘤標本的WES資料計算TMB，同時計算FoundationOne® assay檢測的315個基因的突變數，與預期一致，兩種方法計算的TMB高度相關（R2=0.98）。這一結果證實，採用FoundationOne® assay靶向整個編碼區的幾百個基因可以準確評估整個外顯子區的突變負荷。
2．揭示腫瘤TMB全貌 研究者同時採用FoundationOne® assay評估FMI實驗室中進行臨床常規檢測的102292例組織標本的TMB，這些組織標本來源於541種不同的腫瘤。整個佇列中，TMB的中位數為3.6m/Mb（範圍：0-1241m/Mb），這與既往採用WES檢測估計的TMB相符。其中，167種不同癌症類型（每種至少50個標本）的TMB分佈. 不同類型癌症患者中位TMB存在較大差異，從0.8m/Mb至45.2m/Mb。與預期相符，有顯著突變暴露的癌症，如肺癌和黑色素瘤，TMB更高（中位TMB分別為7.2m/Mb和13.5m/Mb），目前免疫治療已獲批用於黑色素瘤，NSCLC和膀胱癌等高TMB瘤種。TMB檢測還有助於發現其他高TMB，可能從免疫治療中獲益的瘤種，如皮膚鱗癌，小細胞肺癌，彌漫性大B細胞淋巴瘤等。然而，組織TMB檢測對樣本品質要求高，如果能夠開發一種新的測定TMB的方法，通過檢測血液來源的ctDNA對TMB測定，將具有非常重要的臨床意義。開發bTMB檢測平臺，並在POPLAR和OAK研究中驗證其臨床價值為了克服組織取材的困難和不足，FMI與基因泰克聯合開發了一種基於外周血檢測TMB的方法（bTMB），並評估bTMB能否預測atezolizumab的臨床療效。研究者首先採集10ml外周血，為保證分析結果的準確性，20到100ng的cfDNA用於測序文庫的構建，ctDNA中最高的體細胞突變頻率不能低於1%。接下來，採用FoundationOne® CDx NGS assay檢測1.1 Mb的基因編碼序列，在排除常見的胚系多態性和驅動突變後，計算bTMB。並探索採用不同的bTMB分界值進行分組，以POPLAR研究為訓練集，OAK研究為驗證集，預測atezolizumab療效的bTMB最佳cut-off值。
1. bTMB能可靠的反映腫瘤組織的突變負荷嗎？為評估bTMB法在臨床樣本中的檢驗效能，研究者對比了POPLAR和OAK研究中的組織樣本與患者治療前收集到的血漿樣本bTMB的結果。來源於同一個患者的tTMB（組織）和bTMB（血漿）呈顯著正相關（Spearma秩相關係數=0.64；95%CI：0.56-0.71），陽性一致率（PPA）為64%，陰性一致率（NPA）為88%， 是什麼導致bTMB和tTMB的差異呢？原因可能包括：1）實驗因素（分析方法和實驗平臺），tTMB同時計算等位元基因頻率≥5%的單核苷酸變異（SNV）和插入和缺失（等位基因）變化，而bTMB只計算等位元基因頻率≥0.5%的SNV；2）NSCLC的瘤內異質性，單個部位活檢組織標本的突變譜可能與釋放入血液的ctDNA突變有顯著差異；3）樣本特徵上可能存在差異，例如DNA來源（福馬林固定石蠟包埋的組織來源的DNA與ctDNA）、收集時間、樣本類型（活檢與切除）、診斷階段、組織純度、ctDNA最大體細胞等位元基因頻率（MSAF）和ctDNA輸入品質，都可能導致TMB結果的差異。 在上述眾多的可能因素中，哪一個因素占主導呢？研究者採用69個細胞系的cfDNA同時採用FoundationOne® assay和bTMB 平臺檢測，以確定bTMB和tTMB結果的差異是否源於技術平臺。結果顯示兩者間一致性高達0.93，如下圖5所示。這就說明，實驗因素只是導致兩種不一致性的次要因素，而生物因素（樣本本身存在的差異）才是主要原因。為了證實bTMB平臺檢測變異位點的有效性，研究者還選擇了臨床樣本和細胞系，同時使用bTMB平臺和FACT（FMI已經做過驗證的一款血檢NGS平臺）檢測。結果顯示，陽性一致率（PPA，bTMB陽性/FACT陽性）為93.4%，假陰性來源於0.5%到1.1%低頻變異；陽性預測值（PPV，FACT陽性/bTMB陽性）為93.5%，假陽性來源於0.76%，0.82%，1.56%，位於單堿基串聯重複區域。進一步檢測等位元基因突變頻率（VAFs），對比兩個平臺的一致性。結果顯示，兩者一致性很高R2 = 0.998；僅當VAF較低時，一致性相對降低（R2=0.6783）。腫瘤的異質性是否會影響血液和組織TMB的檢測結果呢？研究者對22例NSCLC患者組織和血漿ctDNA中檢測到的變異位點進行比較。結果顯示，在TMB和bTMB數目均大於30的樣本對中，平均有1/3的變異是ctDNA中特有的，1/4的變異是組織樣本特有的，其他的是兩者均有的（1-1/3-1/4=0.42）。 22例患者中，7例患者ctDNA中檢測到的變異位元點很少，和組織的一致性相對較低。綜上可知，實驗平臺和生信分析方法本身對ctDNA和組織中變異位元點不一致的影響較小，差異主要來源於樣本本身。腫瘤異質性是引起TMB和bTMB不一致的主要原因。此外，ctDNA含量，血漿和組織的取樣時間間隔，也是影響ctDNA和組織中變異位元點不一致的重要因素。
2. 以POPLAR研究為訓練集，探尋bTMB作為預測標誌物的最佳cut-off值採用上述bTMB平臺檢測，是否可以預測免疫治療的療效？研究者首先對POPLAR研究中211例有合格的血漿標本的患者進行bTMB檢測，定義為可評估標誌物人群（biomarker evaluable population，BEP）。分別採用不同的bTMB分界值進行分組分析，結果顯示，在bTMB≥10，≥16 和 ≥ 20的患者中均觀察到atezolizumab組的PFS和OS獲益增強，但在bTMB ≥16水準有最佳表現 PFS （HR = 0.57；OS HR = 0.56）。最終確定以bTMB≥16作為cut-off值，並在III期研究OAK中進行驗證。
3. OAK研究確認bTMB可以作為預測免疫治療療效的非侵入性標誌物在OAK研究中583例患者有合格的血漿標本可以進行bTMB檢測，這些患者定義為BEP人群。其中，bTMB≥16的患者占27%（N=158）。在bTMB≥16的亞組中，atezolizumab組患者的PFS顯著優於多西他賽（HR 0.65；95%CI：0.47-0.92；P=0.012），。在OAK研究中，bTMB≥16的患者亞組和BEP人群的OS獲益相當（HR 0.64；95%CI：0.44-0.92；P=0.017），這可能是受到患者進展後的後續治療影響。在bTMB≥16亞組中，atezolizumab組和多西他賽組的中位OS分別為13.5個月和6.8個月。
4. OAK研究中，bTMB和PD-L1表達的相關性研究者進一步分析了OAK研究中同時檢測了bTMB和PD-L1表達的229例患者，結果顯示，bTMB≥16亞組和PD-L1高表達的患者重疊比例較少。療效相關分析顯示，對比與bTMB≥16或TC3/IC3的患者，bTMB≥16且TC3/IC3的患者從atezlizumab治療中獲益最大。
bTMB可作為tTMB檢測的重要替代手段，將在前瞻性研究中進一步驗證隨著越來越多治療靶點的發現，大panel多基因檢測已經成為臨床基因檢測的新趨勢。FoundationOne®assay靶向腫瘤編碼區的315個基因，不僅可以全面檢測患者潛在的治療靶點，同時準確提供TMB資訊，為探尋免疫治療優勢人群提供重要參考。為克服組織檢測的局限性，FMI進一步開發了bTMB檢測平臺，並首次證實採用血漿可以準確和重複檢測TMB。目前，正在進行兩項前瞻性的研究B-F1RST及BFAST研究，在晚期NSCLC一線治療中前瞻性驗證新bTMB檢測的臨床應用前景。
胡毅主任醫師、教授、博士生導師 中國人民解放軍總醫院臨床試驗藥理基地腫瘤專業組負責人 解放軍總醫院呼吸腫瘤及內鏡介入專科主任 美國華盛頓大學訪問學者 中央保健委員會會診專家 中央軍委保健委員會會診專家 中國研究型醫院學會分子腫瘤與免疫治療專業委員會主任委員 北京乳腺病防治學會對外合作部主任及國際醫療與合作專業委員會名譽主任 北京乳腺病防治學會腫瘤免疫治療專業委員會主任委員 中國醫藥教育協會腫瘤免疫和靶向治療專業委員會副主任委員 中國研究型醫院學會腫瘤專業委員會副主任委員 中國宋慶齡基金會腫瘤醫療及產學研聯盟副理事長 中華醫學會腫瘤分會委員 中華醫學生物免疫學會常務理事 國家自然科學基金委員會評審專家
專家點評 近年來，隨著PD-1/PD-L1抑制劑的臨床研究及臨床應用的不斷深入，如何確定有效及可靠的生物標誌物，以説明臨床醫生篩選出適合該治療的患者是腫瘤免疫治療面臨的重要課題。目前，PD-L1的表達和TMB是目前比較公認的免疫治療療效預測標誌物。在肺癌、結直腸癌、黑色素瘤、血液腫瘤等多個瘤種的臨床研究結果表明，TMB可以預測PD-1/PD-L1抑制劑的治療。既往TMB檢測需要採用進行全外顯子測序，檢測比較耗時且成本較高。FMI在10萬例腫瘤標本中進行驗證，結果顯示採用FoundationOne®也可以準確檢測TMB，與全外顯子測序結果高度相關。然而，無論是全外顯子測序還是FoundationOne®檢測，都需要患者提高足夠、高品質的組織標本。但臨床實踐中，約30%的晚期NSCLC患者，無法進行組織活檢。既往我們已經開展了很多採用液體活檢來進行分子突變檢測，如EGFR突變等。能否採用血漿進行TMB的檢測呢？這引發了研究者的興趣。目前，我們已經看到了這方面的探索，研究者首先對bTMB檢測平臺進行嚴謹的驗證，證實bTMB能可靠的反映腫瘤組織的突變負荷。接下來對POPLAR和OAK研究中的患者進行探索性分析，結果顯示bTMB與atezolizumab療效顯著相關，bTMB可預測患者的PFS和OS獲益。這是首項針對血液檢測TMB的研究，並明確了檢測的可行性；因此在技術和理念上都是一大進步。但值得注意的是，這僅是一項回顧性的探索性研究，尚不足以改變臨床實踐。讓人欣喜的是，腫瘤研究者們的理念創新，行動敏捷，目前已經開展了前瞻性的臨床研究（B-F1RST和BFAST 研究）對bTMB檢測平臺進行臨床驗證。毋庸置疑，這是一個非常具有有前景的研究方向。我們期待精准治療時代，免疫治療也能更加精准。
參考文獻
1. Analysis of 100,000 human cancer genomes reveals the landscape of tumor mutational burden. Genome Medicine (2017) 9:34
2. Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab. Nature Medicine 2018.
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